Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 4082 (2023) Citer cet article
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Trois types de modifications méthyliques de l'ADN ont été détectés dans les génomes bactériens, et des études mécanistiques ont démontré le rôle de la méthylation de l'ADN dans les fonctions physiologiques allant de la défense des phages au contrôle transcriptionnel de la virulence et aux interactions hôte-pathogène. Malgré l’omniprésence des méthyltransférases et l’immense variété de modèles de méthylation possibles, la diversité épigénomique reste inexplorée pour la plupart des espèces bactériennes. Les membres du groupe Bacteroides fragilis (BFG) résident dans le tractus gastro-intestinal humain en tant qu'acteurs clés des communautés symbiotiques, mais peuvent également établir des infections anaérobies de plus en plus multirésistantes. Dans ce travail, nous utilisons des technologies de séquençage à lecture longue pour effectuer une analyse pangénomique (n = 383) et panépigénomique (n = 268) d’isolats cliniques de BFG cultivés à partir d’infections observées au centre clinique des NIH sur quatre décennies. Notre analyse révèle qu'une seule espèce de BFG héberge des centaines de motifs de méthylation de l'ADN, la plupart des combinaisons de motifs individuels se produisant uniquement dans des isolats uniques, ce qui implique une immense diversité de méthylation non échantillonnée au sein des épigénomes BFG. L'exploration des génomes BFG a identifié plus de 6 000 gènes de méthyltransférase, dont environ 1 000 étaient associés à des prophages intacts. L'analyse du réseau a révélé un flux génétique important entre des génomes de phages disparates, ce qui implique le rôle de l'échange génétique entre les phages BFG en tant que l'une des sources ultimes de la diversité de l'épigénome BFG.
La méthylation de l'ADN génomique a été détectée dans les trois domaines de la vie cellulaire ainsi que dans les virus1,2,3. Les génomes eucaryotes présentent une méthylation dynamique de la cytosine en position C5 (5mC) dans certains contextes CpG (5'-CG-3'), et la régulation de cette méthylation CpG sur des sites spécifiques affecte la transcription4, la dynamique de réparation du génome et le compactage du génome5. En revanche, les bactéries présentent une méthylation de l'ADN spécifique à un motif (par exemple, 5'-CC-6mA-TGG-3'), où presque toutes les instances d'un motif donné peuvent être méthylées6. Semblable aux génomes eucaryotes, les modifications 5mC sont courantes ; cependant, les génomes bactériens présentent une méthylation supplémentaire en position N4 des cytosines (4 mC) et, le plus souvent, en position N6 des adénines (6 mA)6. La méthylation de l'ADN bactérien est réalisée par des ADN méthyltransférases, dont certaines semblent être présentes et actives dans toutes les souches d'une espèce donnée (par exemple, Dam, qui modifie le GATC chez Escherichia coli), tandis que d'autres ADN méthyltransférases et les gènes qui les codent sont transitoirement activés. acquis et perdus au fil du temps et ne sont pas essentiels à la viabilité de la culture7. Classiquement, la méthylation de l’ADN bactérien a été comprise principalement comme un sous-produit de la défense anti-phage basée sur des systèmes de restriction-modification8. Cependant, d’autres conséquences physiologiques du maintien de l’ADN méthylé, souvent sur des milliers de locus, sont désormais devenues claires. Des études ont démontré le rôle de la méthylation de l'ADN bactérien dans la régulation de l'activité transcriptionnelle contrôlant les phénotypes de virulence9,10,11 et d'autres programmes physiologiques12,13, la stabilité du génome14,15 et affectant la fréquence de mutation au sein des motifs méthylés16,17, similaire aux observations dans les systèmes eucaryotes.
Les bactéries du groupe Bacteroides fragilis (BFG) représentent plus d’une douzaine d’espèces dans les genres Bacteroides, Parabacteroides et Phocaeicola récemment introduits18. Ces symbiotes abondants peuvent facilement être trouvés vivant de manière anaérobie dans le tractus gastro-intestinal humain et ont été impliqués dans de nombreuses fonctions métaboliques et immunitaires importantes19,20,21. Elles font également partie des bactéries les plus fréquemment récupérées lors d’infections anaérobies extra-intestinales et sont de plus en plus résistantes à de nombreux antibiotiques, notamment les céphalosporines et les carbapénèmes22,23. Leur vaste champ phénotypique est rendu possible en partie par la variation de phase, un ensemble de locus d'utilisation des polysaccharides et leur utilisation de promoteurs inversibles .
5 kb each) could be detected in assemblies (Supplementary Fig. 1C). The numbers of identified rRNA operons per circular chromosome corresponded to the expected values for the species in almost all cases based on data derived from the Ribosomal RNA Database27./p>20,000 sampled genes within the dataset, implying that an immense number of additional gene families await discovery within the BFG. This pangenome openness is largely consistent with gut-derived Bacteroides metagenome assembled genomes32./p>3 kb in length encoding only accessory genes, Supplementary Data 3) were extracted from 414 genomes representing 13 species for which three or more genomes were available (378 genomes from this study and 36 genomes from NCBI)33. Comparison of each accessory region sequence with all others in this set demonstrated that >10% of such regions were shared between species, suggesting horizontal transfer (Fig. 2c). Each accessory region was probed for a variety of features, and it was found that phage, phage defense systems, DNA methyltransferases, conjugative machinery, episomes/plasmids, and antimicrobial resistance (AMR) genes were all more common in accessory regions detected in three or more species (Fig. 2c). For instance, accessory regions encoding the tetracycline resistance gene tet(Q) and/or a cassette with genes tet(X)1, tet(X)2, and the aminoglycoside modifying enzyme aadS were detected in 12 of 13 species analyzed (Fig. 2 and Supplementary Fig. 4), likely confirming a history of selective pressure from tetracycline and aminoglycoside compounds./p>95% average nucleotide identity (see Methods) (Supplementary Fig. 5A). The majority of circular contigs (550 out 575; 95.7%) had recognizable plasmid genes such as replicases or relaxases (see Methods), and a proportion of the remainder may represent replicative intermediates of transposons, but this was not analyzed further. Despite the ubiquity of both plasmids/episomes and AMR genes in the sequencing data, we found that most of these AMR genes were not located on plasmids/episomes (53 out of 1911 AMR genes were located within circular plasmid/episome contigs) among BFG species. The overwhelming majority (>97.2%) of AMR genes appeared to be located within chromosomes, and many were associated with integrative elements23. Many of the AMR genes encoded by plasmids/episomes also appeared associated with integration of integrative elements into plasmid backbones, consistent with possible shuttling of AMR genes between chromosomes and plasmids/episomes (Supplementary Fig. 5B)./p>90% of genomes in a species, ‘Shell’ was defined as presence in >10% and ≤90% genomes in a species, and ‘Cloud’ was defined as presence in <10% of genomes in a species./p>90% amino acid identity to previously identified DNA methyltransferases. Interestingly, in the course of our analysis, we observed that within each species, there is a positive correlation between genome size and number of putative DNA methyltransferases (Supplementary Fig. 6). BFG-632 is the longest genome in the entire collection, consistent with the greatest number of methyltransferases./p> = 95 and AF > = 85 were counted. Note that accessory region sequences can often consist of multiple mobile genetic elements or genomic islands in tandem, and no attempt was made to separate individual elements within these regions with the exception of bacteriophages./p>50 copies per chromosome), and in some cases these high copy number plasmids/episomes were represented in lower copy number in companion libraries sequenced on the same flow cell. We assessed that this was likely library cross-contamination and to reduce the likelihood of artifactual assignment of plasmids/episomes to the incorrect library, we excluded circular contigs with coverage that was either 80% of the coverage value of the bacterial chromosome or less or if the coverage was less than 30-fold on average across the sequence. This may have resulted in an underestimate of the true number of plasmids/episomes. Furthermore, the Flye assembler occasionally artifactually assembles sequences as concatemers of two or more tandem copies. Each circular sequence was aligned to itself with BLASTN, and, if the total length of the alignment was greater than 140% of the total length of the sequence, the episome was trimmed down to one unit length to eliminate potential artifactual tandem duplications. To determine if the filtered sequences had plasmid-associated genes, each sequence was run through MOBsuite75 followed by RPS-BLAST against the CDD database76 with flags “ -evalue 1e-2 -seg yes”. Hits were then cross-checked against a list of models related to plasmid replicases, relaxases, conjugative machinery, integrases, and transposes (Supplementary Data 14). Also, Abricate was run as described above on each sequence. Plasmids/episomes were clustered into approximate operational taxonomic units (OTUs) using anicalc and aniclust from CheckV with flags “--min_ani 95 --min_tcov 85” (minimum ANI = 95%, minimum AF = 85%). The network graph was visualized in Cytoscape77./p>10 Tb). Requests for materials associated this work require a standard NIH Material Transfer Agreement with the NIH and U.S. Government. Requests for materials should be addressed to John Dekker at [email protected]./p>
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