Conception et validation d'amorces PCR spécifiques à Dolosigranulum pigrum utilisant le génome bactérien central

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6110 (2023) Citer cet article

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Dolosigranulum pigrum : une bactérie lactique de plus en plus reconnue comme un membre important du microbiome nasal. Actuellement, il existe peu d’options rapides et peu coûteuses pour confirmer les isolats de D. pigrum et détecter D. pigrum dans des échantillons cliniques. Nous décrivons ici la conception et la validation d’un nouveau test PCR ciblant D. pigrum qui est à la fois sensible et spécifique. Nous avons conçu un test PCR ciblant murJ, un gène d'espèce principale à copie unique identifié grâce à l'analyse de 21 séquences du génome entier de D. pigrum. Le test a atteint une sensibilité et une spécificité de 100 % contre D. pigrum et divers isolats bactériens, ainsi qu'une sensibilité globale de 91,1 % et une spécificité de 100 % à l'aide d'écouvillons nasaux, détectant D. pigrum à un seuil de 1,0 × 104 copies du gène de l'ARNr 16S de D. pigrum. par écouvillon. Ce test ajoute un outil de détection fiable et rapide de D. pigrum à la boîte à outils des chercheurs en microbiome étudiant le rôle des bactéries généralistes et spécialisées dans l’environnement nasal.

Dolosigranulum pigrum est une bactérie Gram positive non sporulée de la famille des Carnobacteriaceae1 que l'on trouve couramment dans la cavité nasale humaine2,3. Décrit pour la première fois en 1993 sous la forme de petites colonies blanches présentant une bêta-hémolyse1, D. pigrum reste mal compris et constitue la seule espèce de Dolosigranulum connue à ce jour. Épidémiologiquement, D. pigrum a été associée à l’état sain du microbiome nasal3,4. Plus précisément, la colonisation des voies respiratoires supérieures par D. pigrum est associée négativement au portage de Staphylococcus aureus5,6,7,8,9. Plus récemment, D. pigrum s’est avéré être plus abondant dans le nasopharynx des patients atteints d’infections asymptomatiques par le SRAS-CoV-2 que chez les patients présentant des symptômes plus graves10.

Des méthodes rapides et rentables pour l’identification de D. pigrum sont nécessaires pour faciliter les futures études cliniques et in vitro. Les méthodes biochimiques standards sont coûteuses et prennent du temps, tout comme les méthodes basées sur le séquençage. L’analyse du temps de vol par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) est rentable, mais ne peut pas être utilisée pour détecter D. pigrum directement à partir d’échantillons cliniques. En utilisant une approche basée sur le génome central, nous avons conçu et validé un test basé sur la PCR qui peut être utilisé pour confirmer les isolats de D. pigrum et détecter la présence de D. pigrum directement à partir d'échantillons cliniques.

Nous avons d'abord analysé la diversité génétique de 21 séquences du génome entier de D. pigrum disponibles (n = 7 du NCBI et n = 14 des génomes internes de D. pigrum, tableau S1). Nous avons extrait 87 993 SNP de régions non recombinées du génome central et examiné la diversité génétique sur la base de la phylogénie du maximum de vraisemblance (Figure S1). Cela a montré plusieurs lignées distinctes de D. pigrum, ce qui indique à la fois la nature non clonale de D. pigrum et la robustesse de la collection de génomes. Nous avons ensuite généré et analysé le pan-génome de D. pigrum pour identifier 1 291 gènes centraux et 357 gènes accessoires. Pour les cibles potentielles du test, nous nous sommes concentrés sur les 1 291 gènes principaux.

La découverte des gènes cibles du test était un processus en plusieurs étapes (Fig. 1). Nous avons supprimé les gènes ribosomiques (n = 71) et les gènes ayant des homologues dans d'autres genres (n = 345). Un filtrage manuel des gènes cibles du test choisis au hasard parmi les 843 gènes d'espèces principales à copie unique a été effectué, exigeant que le gène cible du test : (a) soit présent dans les 21 génomes de D. pigrum, (b) doit avoir moins de 70 % d'identité de similarité et de couverture contre des séquences de taxons non Dolosigranulum par BLAST, (c) contiennent des séquences d'amorces directes et inverses répondant aux critères de conception de Primer3 et qui ont moins de 50 % d'identité de similarité et de couverture contre des séquences de taxons non Dolosigranulum par BLAST.

Approche de base basée sur le génome pour la conception des tests. Représentation schématique de l’approche adoptée pour exploiter le pan-génome pour les cibles d’analyse. Chaque étape suivante du flux de travail d’analyse du pangénome illustre comment les gènes ont été filtrés pour finalement conserver un génome central unique pour l’organisme d’intérêt.