L’application d’ELISA numérique ultrasensible pour p24 permet une évaluation améliorée du VIH

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 10958 (2023) Citer cet article

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L'avènement de la thérapie antirétrovirale combinée (cART) a joué un rôle déterminant dans le contrôle de la réplication et de la transmission du VIH-1 et dans la diminution de la morbidité et de la mortalité associées. Cependant, le cART seul n'est pas capable de guérir le VIH-1 en raison de la présence de cellules immunitaires infectées de manière latente et à longue durée de vie, qui réensemencent la virémie plasmatique lorsque le cART est interrompu. L'évaluation des stratégies de guérison du VIH à l'aide de méthodes de culture ex vivo pour mieux comprendre la diversité du VIH réactivé, l'excroissance virale et la dynamique de réplication sont améliorées à l'aide d'un test ELISA numérique ultrasensible basé sur la technologie à matrice unique (Simoa) pour augmenter la sensibilité de la détection des points finaux. . Dans les tests de croissance virale (VOA), il a été démontré que la croissance exponentielle du VIH-1 dépend de la taille initiale de l'éclatement du virus dépassant un seuil de croissance critique de 5 100 copies d'ARN du VIH-1. Ici, nous montrons une association entre les concentrations ultrasensibles de Gag p24 du VIH-1 et le nombre de copies d’ARN du VIH-1 qui caractérisent la dynamique virale en dessous du seuil de réplication exponentielle. Le séquençage du génome unique (SGS) a révélé la présence de plusieurs séquences identiques du VIH-1, indiquant une réplication de faible niveau se produisant en dessous du seuil de croissance exponentielle au début d'une VOA. Cependant, SGS a en outre révélé diverses variantes du VIH apparentées, détectables par des méthodes ultrasensibles qui n'ont pas réussi à établir une croissance exponentielle. Dans l'ensemble, nos données suggèrent que la croissance virale se produisant en dessous du seuil nécessaire pour établir une croissance exponentielle en culture n'exclut pas la compétence de réplication du VIH réactivé, et la détection ultrasensible du VIH-1 p24 peut fournir une méthode pour détecter des variantes auparavant non quantifiables. Ces données soutiennent fortement l'utilisation de la plateforme Simoa dans une approche à plusieurs volets pour mesurer la charge virale latente et l'efficacité des interventions thérapeutiques visant à guérir le VIH-1.

Bien que le traitement antirétroviral combiné (TARc) contrôle la réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) et ralentisse considérablement la progression de la maladie, l'adhésion à vie au régime de TARc prescrit est nécessaire en raison de la présence de réservoirs viraux à longue durée de vie capables de résurgence. lorsque le traitement est interrompu1,2,3,4,5. Ce réservoir s’établit très tôt au cours de l’infection, largement dispersé dans les tissus lymphoïdes de l’organisme, et demeure un obstacle majeur à l’éradication du VIH-16. Les lymphocytes T CD4+ au repos sont un type de cellule bien caractérisé qui contient une partie du réservoir latent du VIH. Un certain nombre d'essais cliniques étudient actuellement les effets des agents d'inversion de latence et de l'expansion immunitaire anti-VIH sur la clairance de ces cellules7,8.

Pour déterminer l’efficacité des stratégies de guérison du VIH-1, une mesure précise de la fréquence des cellules infectées latentes est d’une extrême importance. Les tests conventionnels basés sur la PCR offrent une vitesse de traitement et une sensibilité accrues par rapport aux méthodes de croissance ex vivo, mais sont incapables de faire la distinction entre les réservoirs compétents qui pourraient rebondir chez un individu et ceux qui ne le pourraient pas9,10,11. Récemment, un certain nombre de groupes ont signalé une amélioration de la détection des génomes proviraux intacts à l’aide de plusieurs amorces et sondes par rapport aux parties conservées du génome viral12,13. Cependant, on estime que 30 à 40 % des virus amplifiés par cette méthode peuvent encore être défectueux, en partie à cause de polymorphismes de séquence limitant l’amplification réussie du provirus intact13,14,15. À l’autre extrême se trouvent les méthodes basées sur la culture, telles que le test quantitatif d’excroissance virale (QVOA), qui est considéré comme la référence en matière de détection des virus compétents pour la réplication. Cependant, l’interrogation du QVOA a révélé qu’il sous-estime la taille réelle du réservoir latent en raison du fait qu’une partie des provirus reste non induite après un seul cycle de stimulation cellulaire11,16.

0.0722, conventional ELISA p > 0.0893). Taken together, these results suggest that digital ELISA effectively shortens the duration of QVOA culturing, resulting in reduction of efforts and costs while measuring latent HIV-1 reservoirs, which is of major importance to the HIV-1 cure agenda42,43./p> 15 year follow-up sample collected from a study participant of an RV130/514 clinical trial (NCT01013415) through conventional ELISA did not yield a reservoir measurement, however, digital ELISA identified HIV-1 p24 above the LOD in 7 out of 16 supernatants (Fig. 1S). All the measurements collected by digital ELISA exhibited HIV-1 p24 molecule concentrations below the critical threshold of genome copy equivalents required to establish exponential replication, suggesting either inadequate levels of virus reactivation or insufficient levels of replication inside the wells, consequently leading to failure to launch ex vivo exponential outgrowth in culture. Ultimately, the QVOA coupled with digital ELISA produced a reservoir measurement (0.778 p24-producing cells per million resting CD4 T cells with a 95% confidence interval from 0.365 to 1.665) whereas conventional ELISA and integrated HIV-1 DNA assay did not return a quantifiable measurement (Fig. 1S)./p>

0.98), confirmation of the standard curve, quality controls, sample CVs (< 20%), ambient temperature and humidity monitoring during the run, adjustment of assay definition concentrations to that of the kit lot, in addition to assessment of any relevant errors during the analysis (e.g. too much fluorescence scored as positive and fluorescence below the standard curve scored as negative) as per manufacturer’s instructions. Four-parameter logistic (4PL) regression fitting, 1/y2 weighted, was used to estimate the concentration of p24 in the culture supernatants using the manufacturer’s software analysis. Wells were considered positive for the presence of p24 if the concentration was above 0.0515 pg/mL./p>