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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 13017 (2023) Citer cet article

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L’identification des espèces est nécessaire pour empêcher l’introduction de ravageurs exotiques des plantes par le biais du commerce mondial. Beaucoup de ces ravageurs sont peu étudiés et manquent de données de séquences d’ADN accessibles au public sur lesquelles pourraient s’appuyer des méthodes d’identification moléculaire rapide. L'une de ces lignées est le genre Chrysodeixis, qui comprend trois espèces potentiellement préoccupantes pour les initiatives commerciales des États-Unis : C. includens, C. chalcites et C. eriosoma. Nous décrivons ici une méthode pour générer des profils d’ADNr 45S robustes à l’aide d’un séquençage à lecture longue afin de clarifier les relations évolutives et de développer une technique d’identification PCR en temps réel. Un tel outil d'identification sera utile pour différencier rapidement les espèces de Chrysodeixis préoccupantes en quarantaine lorsque les méthodes traditionnelles d'identification morphologique sont insuffisantes. Les méthodes moléculaires telles que celle-ci réduisent considérablement le temps passé à identifier chaque échantillon, permettent la détection de l’ADNe, augmentent considérablement le débit et augmentent la probabilité de détection. Les méthodes présentées ici seront généralement adaptables à tous les taxons de lépidoptères peu étudiés qui nécessitent un test de diagnostic moléculaire et, avec ajustement ou test des amorces, pourraient être appliquées à tout groupe pour lequel le développement de profils d’ADNr dans un environnement de laboratoire s’avérerait utile.

Le diagnostic des espèces est de plus en plus important dans un monde globalisé où la translocation d’espèces par l’intermédiaire de l’homme (en particulier les plantes et les insectes) se produit à un rythme plus élevé que jamais1,2. Avec l’augmentation des mouvements de personnes et du transport mondial de produits agricoles, notamment les cultures vivrières, les fleurs coupées et le bois d’emballage, la capacité de détecter et d’identifier rapidement tout insecte associé est primordiale pour limiter l’introduction et l’établissement d’espèces nuisibles envahissantes3,4. Aux États-Unis, les inspections des marchandises et des marchandises aux ports d'entrée et les enquêtes nationales sur les ravageurs exotiques sont utilisées pour détecter la présence d'insectes nuisibles. L'identification de ces spécimens peut être difficile et repose souvent sur un enregistrement précis de l'hôte sur lequel l'organisme a été trouvé et de l'origine de l'envoi, qui peuvent tous deux être compliqués en raison du transbordement à travers plusieurs endroits5. Dans de nombreux cas, les organismes nuisibles interceptés ne peuvent être identifiés qu’au niveau de la famille, de la sous-famille ou du genre. Cela est particulièrement vrai pour les lépidoptères, qui sont presque exclusivement interceptés au stade larvaire.

L'identification des insectes capturés lors d'enquêtes nationales est également difficile, car l'attraction croisée vers les leurres à phéromones peut entraîner la capture de dizaines, voire de centaines, de non-cibles similaires dans un seul piège. Une identification rapide des cibles potentielles est souhaitable pour détecter les espèces envahissantes avant leur établissement (c'est-à-dire la phase de latence6), mais cela nécessite souvent la dissection de chaque spécimen ou une approche moléculaire, telle que le codage-barres de l'ADN de la cytochrome c oxydase 1 (CO1)7. Les deux approches prennent du temps et peuvent ne pas être fiables pour les espèces qui sont auparavant non décrites, mal caractérisées ou pour lesquelles il manque des données de séquence accessibles au public. Pour améliorer les chances de détection des espèces envahissantes, des analyses moléculaires rapides ou à haut débit ont été développées pour certaines espèces d'insectes nuisibles couramment interceptées et potentiellement envahissantes (par exemple8,9,10,11). Non seulement les techniques d’identification moléculaire à haut débit augmentent la probabilité de détection, mais elles réduisent également considérablement le temps et les coûts nécessaires pour réaliser les identifications, en particulier dans le cas d’analyses multiplexées12,13. Certaines espèces qui présentent un potentiel élevé d'invasion sont également sous-étudiées et manquent d'informations de base telles que le placement phylogénétique et la description des espèces sœurs, la variation phylogéographique au sein de l'espèce ou les données de séquence accessibles au public7,14.

Bien qu'une vaste base de données de séquences CO1 soit disponible pour de nombreuses espèces (c'est-à-dire BOLD15, GenBank16), cette région peut être mal adaptée au développement de techniques basées sur les séquences d'ADN comme la PCR en temps réel en raison de sa teneur élevée en AT, de sa faible variation interspécifique et /ou une forte variation intraspécifique résultant d’une évolution rapide et d’une dérive génétique17. Dans ces situations, l’identification des espèces peut souvent être effectuée de manière fiable à l’aide de régions d’ARN ribosomal 45S (ARNr). Parmi les premiers acides nucléiques séquencés, l’ARNr 45S est très abondant dans le génome et relativement court18. L'unité d'ARNr est composée de répétitions en tandem structurellement conservées composées d'un espaceur transcrit externe (ETS), d'un ARNr 18S, d'un espaceur transcrit interne (ITS) 1, d'un ARNr 5,8S, d'un ITS2 et d'un ARNr 28S19. Ces propriétés de l'ARNr, ainsi que la conservation des séquences dans les régions codantes et les taux élevés d'évolution dans les régions ITS non codantes de l'ADN ribosomal sous-jacent (ADNr), ont conduit à l'utilisation de ce locus pour des études phylogénétiques sur l'ensemble de l'arbre de vie20,21. À partir de ces études phylogénétiques, de grandes quantités de données sur les séquences d’ADNr ont été rendues publiques, à partir desquelles les chercheurs ont développé des méthodes d’identification rapide des espèces. Ces locus sont idéaux pour de tels tests moléculaires car les régions ITS sont relativement conservées au sein des espèces, très variables entre les espèces (avec à la fois des mutations ponctuelles et des indels) et présentes en nombre élevé de copies dans le génome. Cela en fait des candidats idéaux pour développer des tests PCR basés sur des sondes8,22,23 et permet l’amplification de ces séquences même à partir d’ADN dégradé ou d’échantillons environnementaux de haute complexité24,25. Étant donné que les séquences codant pour l’ARNr 18S, 28S et 5,8S sont hautement conservées, le développement d’amorces universelles pour amplifier cette région entière est possible même si aucune donnée sur la séquence d’ADNr n’est disponible pour l’espèce en question. Cependant, en raison du nombre élevé de copies au sein d’un même génome, des différences nucléotidiques existent entre les copies au sein d’un même individu. Ces variations intraindividuelles sont considérées comme des ribotypes26,27, et une telle variation ribotypique doit être évitée lors du développement d'une technique fiable basée sur l'ADN pour l'identification des espèces, mais la caractérisation de la variation ribotypique est rarement achevée. L’utilisation d’une méthode de séquençage à haut débit est donc utile pour caractériser la diversité ribotypique et pour différencier les variations fixes et transitoires qui existent entre les répétitions.