Sécurité préclinique et biodistribution de CRISPR ciblant le SIV en non

Thérapie génique (2023)Citer cet article

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Dans cette étude, nous démontrons l'innocuité et l'utilité de la technologie d'édition génique CRISPR-Cas9 pour l'édition in vivo de l'ADN proviral chez les macaques rhésus infectés par le virus de l'immunodéficience simienne (SIV) traités par ART et contrôlés par le virus, un modèle établi pour l'infection par le VIH. EBT-001 est un vecteur basé sur AAV9 délivrant SaCas9 et des ARN doubles guides conçus pour cibler plusieurs régions du génome du SIV : les LTR viraux et le gène Gag. Les résultats présentés ici démontrent qu'une seule inoculation IV d'EBT-001 à chacun des 3 niveaux de dose (1,4 × 1012, 1,4 × 1013 et 1,4 × 1014 copies de génome/kg) a entraîné une biodistribution large et fonctionnelle d'AAV9-EBT-001 à réservoirs tissulaires connus de SIV. Aucun effet hors cible ni pathologie anormale n’a été observé, et les animaux ont retrouvé leur poids corporel normal après avoir reçu l’EBT-001. Il est important de noter que les macaques ayant reçu les deux doses les plus élevées d’EBT-001 ont montré une amélioration du nombre absolu de lymphocytes par rapport aux témoins traités aux antirétroviraux. Pris ensemble, ces résultats démontrent la sécurité, la biodistribution et l’édition in vivo de l’ADN proviral après l’administration IV d’EBT-001, soutenant le développement ultérieur de l’édition génétique basée sur CRISPR en tant qu’approche thérapeutique potentielle pour le VIH chez l’homme.

Les primates non humains (PSN) ont été utilisés pour comprendre l'infection lentivirale, la pathobiologie, la pathogenèse et pour prédire l'efficacité clinique depuis le début de la pandémie du VIH, et récemment pour évaluer les stratégies d'éradication et les approches innovantes pour guérir le VIH [1,2,3] . Dans les études présentées ici, nous avons utilisé des macaques rhésus indiens infectés par le virus de l'immunodéficience simienne (SIV) et traités par antirétroviraux (ART) pour évaluer la biodistribution, la sécurité et la capacité du traitement d'édition génique CRISPR/Cas9 (EBT-001) à cibler les SIV administré en une seule perfusion intraveineuse (IV) en bolus [4]. EBT-001 (codant pour les ARN guides de ciblage du SIV) est l'homologue simien de l'EBT-101 (codant pour les ARN guides de ciblage du VIH) et est composé d'une construction CRISPR tout-en-un encapsulée par un virus adéno-associé de sérotype 9 (AAV9) exprimant simultanément le Endonucléase SaCas9 et ARN double guide (ARNg) ciblant les longues répétitions terminales virales (LTR) et le gène Gag. EBT-101 est conçu pour l'élimination de grandes séquences d'ADN provirales intégrées du SIV positionnées entre les sites cibles CRISPR prévus, générant ainsi 3 délétions possibles : 5′LTR à Gag, Gag à 3′LTR et 5′LTR à 3′LTR. . L'utilisation de l'administration d'AAV9 est étayée par nos études initiales sur des modèles animaux petits et grands, en plus d'un vaste ensemble de preuves issues d'essais cliniques de thérapie génique antérieurs dans lesquels l'AAV9 a montré l'innocuité, l'efficacité et de larges propriétés de biodistribution [4,5,6]. . Nous présentons ici des données plus complètes sur la sécurité, y compris des analyses approfondies hors cible et la biodistribution de doses multiples (1 012, 1 013, 1 014 GC/kg) d'EBT-001 et une étude prolongée (3 et 6 mois) chez un macaque rhésus indien. Modèle SIV. Cette étude préclinique sur l'innocuité, la biodistribution et l'efficacité a démontré qu'une seule administration IV d'EBT-001 pour l'édition du SIV était bien tolérée et pouvait largement atteindre et exciser les réservoirs viraux dans les PSN sans aucun effet hors cible observé. Ces résultats confirment qu'une seule inoculation IV d'EBT-101 pour l'édition du gène du VIH peut être utilisée pour atteindre les réservoirs viraux dans les tissus infectés dans tout le corps pour une édition in vivo sûre et spécifique de l'ADN proviral latent du VIH.

Cette étude a été approuvée par l'IACUC de BIOQUAL, protocole numéro 18-036. Douze macaques rhésus indiens mâles (Macaca mulatta) ont été obtenus auprès du Caribbean Primate Research Center de Porto Rico. Deux études ont été réalisées. Le premier était un n = 10 avec des animaux randomisés par un statisticien en quatre groupes de traitement, 3 non traités, 3 traités avec 1,4 × 1012 GC/kg d'EBT-001 et 4 traités avec 1,4 × 1013 GC/kg d'EBT-001 (2 autopsiés à 3 mois et 2 à 6 mois après EBT-001). La randomisation a été effectuée à l'aide d'une méthode de randomisation par blocs permutés, avec la restriction que les animaux appariés avec des partenaires sociaux appartenaient au même groupe. La deuxième étude portait sur un n = 2 utilisant une dose d'EBT-001 1 log supérieure de 1,4 × 1014 GC/kg et aucune randomisation n'a été réalisée ici. Tous les animaux ont été dépistés et étaient triples négatifs pour Mamu-A*01, Mamu-B*08 et Mamu-B*17. Tous les macaques rhésus ont été reçus à l'installation Piccard Drive de BIOQUAL, à Rockville, MD, où toutes les études in vivo décrites ici ont été réalisées. Les macaques rhésus ont fait l'objet d'une sérologie pré-dépistée pour les rétrovirus (STLV et SIV), le virus SA8, le virus SHF et le virus de la rougeole avant l'étude. Les animaux ont été infectés par SIVmac239 (un cadeau du Dr Preston Marx, Tulane Primate Center). Les animaux ont commencé un traitement antirétroviral quotidien comprenant du ténofovir (TDF ; #T018500 ; 15 mg/kg/animal), de l'emtricitabine (FTC ; #E525000 ; 50 mg/kg/animal) et du dolutégravir (DTG ; #D528800 ; 2,5 mg/ kg/animal) (Toronto Research Chemicals) à partir du jour 28 après l'infection et la nécropsie s'est poursuivie. Les animaux ont été observés pour la morbidité, la mortalité, les blessures et la disponibilité de nourriture et d'eau. Tous les animaux en mauvaise santé ont été identifiés pour une surveillance plus approfondie, un traitement clinique et une éventuelle euthanasie. Les observations comprenaient, sans toutefois s'y limiter, l'évaluation de la peau, du pelage, des yeux, des oreilles, du nez, de la cavité buccale, du thorax, de l'abdomen, des organes génitaux externes, des membres et des pieds, les effets respiratoires et circulatoires, les effets autonomes tels que la salivation, les effets sur le système nerveux. y compris tremblements, convulsions, réactivité à la manipulation, effets neurologiques/comportementaux et comportement inhabituel. La charge virale du VIS (limite de détection de 50 copies/mL) a été mesurée dans le plasma d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) au cours de l'infection (matériel et méthodes supplémentaires). Du sang total a été collecté plusieurs jours au cours de la période d'étude et soumis à IDEXX BioAnalytics, Inc. pour une analyse de formule sanguine complète (CBC) et pour la chimie du sang. Les animaux ont reçu une dose d'EBT-001 6 mois après l'infection par le SIV avec une perfusion IV lente à un débit de 1 mL/min. La quantité de vecteur EBT-001 à administrer a été ajoutée à un total de 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1X pour chaque animal en fonction du poids corporel et de la dose actuels (tableau S2). Les animaux ont subi une autopsie complète 3 ou 6 mois après la perfusion d'EBT-001 (matériel et méthodes supplémentaires). Aucun aveuglement sur les groupements d'animaux n'a été réalisé chez BioQual.